Prelievo di Materiale Biologico

Le ragioni per cui può essere necessario procedere al prelievo di materiale biologico di un animale sono molteplici e comprendono:

• Studi sulla consanguineità, utili al fine di mantenere la necessaria variabilità genetica all’interno dell’allevamento.
• Riconoscimento di geni responsabili di malattie genetiche per l’identificazione precoce dei soggetti malati e dei portatori sani.
• Identificazione delle varianti alleliche responsabili di alcuni caratteri morfo-funzionali, quali ad esempio il colore del mantello.
• Certificazioni forensi.
• Assistenza agli allevatori ed alle società di razza per la programmazione di piani di selezione.
• Controllo di parentela, cioè un’analisi volta a verificare che la paternità e la maternità di un cucciolo corrisponda a quella dichiarata.

Ad esempio, l’articolo 8 della normativa E.N.C.I. (Ente Nazionale della Cinofilia Italiana), riguardante il controllo della parentela, stabilisce che l’ufficio Centrale del Libro Genealogico ogni anno possa sottoporre a verifica della corretta attribuzione della paternità e maternità un campione di soggetti attraverso l’analisi del loro DNA presso un laboratorio riconosciuto. Il prelievo del campione di materiale biologico ed il suo invio al laboratorio riconosciuto sono obbligatori, al fine di consentire l’eventuale necessità di identificazione con analisi del DNA, per i seguenti riproduttori: a) tutti i riproduttori da ammettere alla riproduzione selezionata; b) tutti gli stalloni che hanno prodotto più di 5 cucciolate; c) tutti gli stalloni usati in inseminazione artificiale; d) tutti gli stalloni esteri in Italia in stazione di monta; e) i campioni di bellezza, di lavoro e riproduttori riconosciuti dall’ENCI prima dell’omologazione del titolo e che ottengano eventuali altri titoli da riportare sul certificato genealogico.

Il prelievo di materiale biologico può essere utilizzato per il deposito del campione biologico, che consta unicamente nella conservazione del campione presso un laboratorio accreditato, oppure per l’analisi del profilo genetico, che implica invece che venga estratto il DNA dal campione e venga effettuato un profilo, tramite marcatori genetici, che identifica unicamente il soggetto.

Per l’analisi del profilo genetico è necessario inviare il campione biologico solo del soggetto da testare, mentre per l’analisi di parentela è necessario fornire sia il campione biologico del soggetto da testare, sia quelli di entrambi i genitori, per poterne verificare la compatibilità.

L’estrazione di DNA da materiale biologico può essere effettuata in diversi modi, da cui ne risultano diversi gradi di qualità. La scelta della metodica di prelievo dipende dall’età del soggetto e dall’utilizzo che si intende fare del campione.

Prelievo di Sangue: 1 ml di sangue in provette contenenti EDTA (un anticoagulante). La provetta deve essere delicatamente agitata per la completa miscelazione con l’anticoagulante. Il prelievo deve essere conservato a temperatura compresa tra + 4 C°/ + 7 C° fino al momento della consegna al Laboratorio.

Prelievo con VetKard: tale sistema consiste in un cartoncino che racchiude un supporto di carta assorbente impregnata di una sostanza chimica che trattiene e stabilizza il DNA. Il prelievo si esegue spalmando una goccia di sangue ottenuta da un piccolo foro effettuato con l’ausilio di un ago sull’animale (per esempio labbro o orecchio) sul cerchio stampato sul cartoncino. Dopo aver lasciato asciugare a temperatura ambiente il cartoncino deve essere riposto in una bustina e spedito in Laboratorio. È sufficiente apporre nello spazio esterno della VET Kard l’identificativo anagrafico del soggetto (nome, razza, n° di ROI) e la data di prelievo. La Vet Kard (opportunamente inserita nel sacchetto provvisto di essiccatore in dotazione con il Kit) viene inviata ai laboratori convenzionati ENCI che effettuano l’analisi del DNA. I campioni su Vet Kard non necessitano di refrigerazione; possono quindi essere trasportati e conservati a temperatura ambiente per lungo tempo: è stata dimostrata la stabilità del DNA genomico su Vet Kard per almeno 14 anni.

Prelievo di Saliva con Tampone “Buccal swab”: per la raccolta di saliva e cellule di sfaldamento della mucosa buccale si utilizzano cotton-fioc o cito-brush. Il tampone sterile deve essere strofinato vigorosamente sulle gengive, preferibilmente sul colletto dentale (il punto di passaggio tra gengiva e dente) evitando le guance e la lingua, prima di riporlo in una provetta di plastica sterile. Il prelievo dovrebbe essere effettuato almeno un’ora dopo che il cane abbia finito di mangiare o bere. Inoltre i soggetti da testare dovrebbero evitare contatti con altri animali per alcune ore prima del prelievo. I bush/tamponi non sono consigliabili nei cuccioli perché continuano a succhiare il latte materno per parecchi mesi dopo la nascita, e può accadere che il prelievo buccale contenga sia cellule appartenenti all’individuo da sottoporre ad analisi sia le cellule somatiche del latte, che fanno riferimento al genotipo materno. In questo caso, la cosa più sicura è il prelievo di sangue, che però spesso nella pratica può risultare difficoltoso, soprattutto se il cucciolo è molto piccolo. Si può quindi optare per una sorta di compromesso, che garantisce il successo nell’esecuzione dell’analisi senza essere invasivo: far eseguire dal proprio veterinario di fiducia una piccola ferita con un ago sul padiglione auricolare per recuperare alcune gocce di sangue con 1 o 2 tamponi sterili.

Nel caso in cui il materiale raccolto con il brush/tampone non fosse sufficiente potrebbe essere richiesto l’invio di un nuovo campione. In ogni caso, per maggiore sicurezza, è consigliabile mandare almeno 2 tamponi per ogni soggetto da testare.

In linea teorica per eseguire un test genetico è quindi possibile utilizzare sia il sangue sia i brush/tamponi. Nella pratica, però è fortemente consigliato utilizzare il sangue, poiché l’analisi è eseguita più velocemente e non si corre il rischio di dovere ripetere il campionamento.

Per reperire i tamponi potete rivolgervi al vostro veterinario di fiducia; in alternativa potete rivolgervi ad una farmacia ben fornita oppure contattare direttamente il laboratorio a cui intendete inviare il campione. I tamponi sono quelli comunemente impiegati per i tamponi faringei dei bambini; è però importantissimo verificare che il contenitore del tampone non contenga terreni o mezzi di coltura.

Prelievo su pelo: bisogna identificare una zona dell’animale con il pelo pulito ed asciutto. Per l’analisi del DNA viene utilizzata la radice; è quindi necessario strappare, e non tagliare, un ciuffo di peli, all’incirca 40, all’animale da testare. I peli possono poi essere attaccati ad un pezzo di scotch, possibilmente ben separati fra loro e con le radici rivolte tutte dallo stesso lato, ed inviati al laboratorio.

Per eseguire una verifica di parentela ENCI il prelievo (sia di sangue, sia di sangue su Vetkard) deve essere effettuato da un medico veterinario che certifica, firmando l’apposito modulo compilato on-line, che il prelievo effettuato appartenga a quel cane, controllando il tatuaggio o il microchip.

In tutti gli altri casi, i laboratori accettano campioni eseguiti direttamente dai proprietari e allevatori ma sul referto sarà indicato che il prelievo non è certificato.

Presso la nostra struttura vi seguiremo in tutte le fasi del percorso diagnostico, dal prelievo del materiale genetico, alla spedizione dei campioni fino alla ricezione dei risultati ed all’impostazione della soluzione personalizzata per il vostro caso.